一、PCR是什么

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。

二、PCR原理

基本反應(yīng)原理

從專(zhuān)業(yè)的角度來(lái)說(shuō)，PCR 由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

1模板 DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 94℃ 左右一定時(shí)間后，使模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

2模板 DNA 與引物的退火 （復(fù)性）：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

3引物的延伸：DNA 模板--引物結(jié)合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的「半保留復(fù)制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2～4 分鐘， 2～3 小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

三、PCR的基本反應(yīng)步驟

1.引物的設(shè)計(jì)：

引物需要自己查找文獻(xiàn)或者自己設(shè)計(jì)，然后交給合適的生物公司來(lái)幫我們合成，合成引物，每管裝1OD。拿到引物后需要加水溶解，但是因?yàn)橐锸强床灰?jiàn)的，所以為了防止溶解過(guò)程中引物的丟失，拿到引物后最好先高速離心（10000rpm, 4°C離心2min）再進(jìn)行加水溶解（ddH2O）。水的體積按引物濃度稀釋100倍，溶解好的引物用小管分裝，每管裝50μl即可，分裝后放-20°C保存。

2.制作模板：

模板的制作可以直接借助試劑盒，一般情況下Trizol的試劑可以完全滿足需要，直接按照試劑盒提示來(lái)做就可以了。

3.建立體系、上機(jī)：

PCR需要用到的DNA聚合酶、buffer、dNTPs。而經(jīng)常用的DNA聚合酶有Taq酶，買(mǎi)的同時(shí)會(huì)附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些還有(NH4)2SO4)。做PCR之前要提醒大家一點(diǎn)，不是所有的PCR都用同樣的反應(yīng)體系的，也就是說(shuō)PCR體系里用到的試劑除了10×Taq Buffer以外，其它其實(shí)都是需要摸條件的，但是按大多數(shù)情況來(lái)說(shuō)，需要調(diào)整的并不多，可能需要調(diào)整的主要試劑是MgCl2（其實(shí)是要調(diào)整Mg2+的濃度）；可能需要控制的條件主要是退火溫度。

4.跑膠驗(yàn)證：

在電泳之前，需要進(jìn)行凝膠的配制，凝膠液配制的過(guò)程并不復(fù)雜，先用天平稱取適量的瓊脂糖粉末，加入到一定體積的1×TAE（Tris、乙酸、EDTA）緩沖液中，微波爐加熱至沸騰，拿出來(lái)?yè)u勻，幫助粉末溶解，反復(fù)沸騰多次直到粉末完全溶解。待溶液不燙手，將核酸染料加入溶液中搖勻，接著將溶液趁熱倒到做膠的凝膠板上，插上梳子（用來(lái)預(yù)留加樣孔），等半小時(shí)左右膠凝固拔下梳子，連膠帶板一起放到電泳槽中，加電泳液至完全淹沒(méi)整塊凝膠（電泳槽中的電泳液也用1×TAE緩沖液）。然后將loading buffer與樣品混合，加入到凝膠小空（“梳子”形成的洞）中，DNA maker作為對(duì)照，同樣加入到篩孔中，然后插上電源開(kāi)始跑膠就可以了，凝膠上有顏色的有兩條帶，等到前面的藍(lán)色帶跑到整塊膠的2/3處停止電泳（斷電），然后把膠拿出來(lái)，放到紫外光下觀察條帶。