免疫共沉淀與免疫沉淀技術所使用的原理與方法大致相似,所不同的是,在免疫共沉淀中,對靶蛋白的結合與沉淀由另一個與之發生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基礎上,通過進一步與其它技術的結合,如聚丙烯酰胺凝膠電泳,還可進一步對靶蛋白的的分子量等特性進行鑒定。下面對此進行詳細介紹。
實驗原理
(1)免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP):利用抗原抗體特異性反應,對某個特定蛋白純化富集的方法,主要過程包括捕獲和固定。
(2)免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP):CoIP是在IP實驗的基礎上進行的擴展,主要用于蛋白之間的互作研究,常被用于鑒定特定蛋白復合物的中已知或未知的蛋白組分。其原理是基于抗體與抗原(靶蛋白)之間的特異性結合,此時如果樣品溶液中存在能與靶蛋白相互作用的目的蛋白,會一同被拉下來,隨后利用SDS-PAGE,Western Blot等方法對得到的目標蛋白進行分析,進而證明兩者間的相互作用。
2、注意事項
*確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體具有特異性強、可大量生產、易標準化等優點,使用單克隆抗體有助于避免污染的發生;
*要確??贵w的特異性,如果抗體不能和細胞溶解物中的抗原結合,則不會引起共沉淀反應;*確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發生的。
3、實驗技巧為了確保最終得到的結果是天然狀態下的相互作用,而不是由于某些方面造成的人工相互作用(也就是“假陽性”),在Co-IP的實驗設計過程中,需要設置正確的對照。假設Co-IP實驗的實驗組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”,則可能出現的“假陽性”及對應需要設置的實驗對照如下表所示:
