一、 取材

1. 注意事項：預冷PBS,提前放入4℃冰箱1-2小時；4%PFA用1XPBS配制，通風櫥恒溫加熱攪拌；灌流時盡可能灌流干凈，洗凈組織中的殘留血液。

2. 步驟：

1) 1XPBS灌流

2) 內固定：灌流4%PFA

3) 外固定：將組織放入4%PFA溶液中48h-72h

4) 沉糖：30%蔗糖（組織沉底可切）

二、 冰凍切片

1. 注意事項：底座預冷10Min；涂OCT，切除小腦便于粘在底座上；全腦涂OCT,切片機凍大于2h，冰箱-20過夜；切片機提前預冷。

三、 免疫熒光染色

1. -20℃冰箱取片，室溫晾干15min（復溫）；

2. PBS洗三次，每次5min

3. 抗原修復（可選步驟），5min 95℃水浴

4. 透膜 0.3%TritonX-100 5-10min (100mlPBS+0.3mL TritonX-100)

5. PBS洗3次

6. 封閉 ：組化筆圈組織，5%BSA或5-10%FBS封閉1h(室溫)，37℃30min.

7. 擦干封閉液

8. 滴加一抗，4℃過夜（濕盒），一般16小時

第二天

9. 漂洗：PBS漂洗3次，每次10min

10. 敷二抗：稀釋比例一般1:500，室溫孵育2h,注意避光；也可37℃ 1小時

11. 漂洗：PBS洗3次，每次5min

12. 擦干，抗熒光淬滅封片液封片

四、 注意事項

1. TritonX-100配好后4℃保存可放很久

2. 冰箱-20℃取出后盡量不要太干

3. 染色過程盡量不要干片

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